原文は
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化学品の培養細胞への細胞毒性の効果は、
細胞の生存(ニュートラルレッド取り入れ)法
で測定される。
連絡先
<省略>
論理的説明
健康な3T3-L1細胞は(株化細胞ATCC CC92.1)、
培養で継続的に維持すると分裂し、
時間の経過とともに増殖をする。
細胞毒性化学品(位置または作用のメカニズムに
かかわらず)が、この過程を妨害するので、
細胞数にも表れるように成長率減少が起る、
というのがこの試験の原理である。
試験化合物の濃度に関係し、増殖抑制の度合いが
毒性を示す。
基本過程
3T3-L1細胞を培養で維持し、濃度の範囲を決めて
試験化合物に暴露する。培養物を24、48、72時間後に
視診し、24時間か72時間の暴露後にニュートラル
レッド取り入れ法で、生細胞数と(または)
細胞蛋白質含有量の総量を測定する。
測定法の特徴は、先にニュートラルレッド(
生細胞数の表示)が測定されて
いれば、同じ培養物でケンアシッドブルー
測定もできることである。試験化学品中の
細胞数を、管理した培養で観察された細胞数そして
計算された成長抑制の割合と比較する。
ID20、ID50、ID80濃度(例えばその濃度が20、50、
80％の成長抑制を生みだす)を測定し、
mg/mlまたはmMで示す。これらの数値で試験
化合物の相対細胞毒性の比較が可能になる。
重要評価
細胞培養の過程； 3T3-L1のような細胞株の
培養と維持は比較的簡単で低コストの
技術ですむ。細胞毒性測定にこのような
培養が使用されると、日常で多くの化学品に
迅速で高繁殖な試験ができるようになる。
この技術には若干の限界がある。：
試験する化合物の注意すべき特徴を数点あげる。
揮発性化学品は試験のコンディションで
蒸発しやすいので、特に化合物の毒性がかなり低い
ときなどは、ID50数値は変化しやすいであろう。
これは、24ウェル プレートではなく 96ウェル プレート
(Knox et al.,1986;Riddell et al.,1986 )に
使用するために過程を適合させたことで
ある程度まで克服できた。つまりこれらのdishesの
ウェルの狭い表面積が蒸発程度を減少させたのである。
その他の化学品で試験し難いものは
水中で不安定または爆発性のあるものを
含む。作者は植物油を溶媒として使用したいくつかの
化合物と共に使用する方法を適用してはいるが、
水溶性物質も試験には不適。
その他の問題は、細胞株の特徴に関連がある。
例えば、急成長の細胞株、代謝活動の非常に
低い細胞と差異のない細胞株など。
それゆえに、in vivo状態への結果の
直接外挿法が問題になる。そのシステムは
毒性媒介または製品への代謝活性化の要求される
化学品の毒性をおそらく過小評価するであろう。
分裂している細胞を攻撃する物質は特にin vivo
でよりも毒性がかなり高くみえるであろう。
血清蛋白質に結合する物質の毒性(例えば、産まれた
ばかりの子牛血清に見られるものなど)も
おそらく過小評価されるであろう。
24時間と72時間の暴露時間；
その過程は適合させられ、24時間または
72時間の暴露時間後の化学品の
毒性細胞測定が可能になるであろう。作者達は
しかしながら、通常は長い暴露時間にすべき
考えであることに重点をおくであろう。
ニュートラル レッド取り入れ測定 ;
ニュートラル レッド は優先的に細胞の
リソソーム・エンドソームに取り入れられる。
それゆえにリソソーム・エンドソームに局部的効果を
もたらす化学品はすべて生細胞と細胞数が
低く(または高い可能性あり)見える結果をもたらす。
しかしこの要因が、リソソームに選択的に
効果を与える化学品発見のために、
システムを有効にさせる。細胞数測定を可能にする
他の試験に関連して使用される際には特にである。
測定法のひとつの大きな難点は、
ニュートラルレッドが直ちに目にみえる
細かい針のような結晶に染みこんでしまう
ことである。これが起ると逆戻りはほぼ不可能なので、
不正確な測定値がでる。いくつかの
化学品はこの沈殿反応を含むので、過程での
目視検査の段階が非常に重要となる(特に
操作時間延長により96ーウェル
プレートでの測定が行われる時)。
ニュートラルレッド取り入れ測定法の利点、難点は
上記されている。評価項目の選択を考慮
$B$9$k$J$i!"%1%s%"%C%7%I%V%k!法の直接比較も価値があるだろう：一端
ニュートラルレッド取り入れ測定を着手したら
最後まで遂行すべし。
例えば
一端細胞がニュートラルレッドと培養されて
リソソームに色素が取り入れられたら、直ちに
凝固させ汚れの除去を続行すべし。
ニュートラルレッド測定のひとつの難点は、
細胞のリソソーム・エンドソームに比較的に
選択的な効果をおよぼす化学品の場合、
生細胞または細胞数の測定値が
一見低く見える可能性があることである。この
一例がクロロギー硫酸塩がリソソーム・
エンドソームのPhを変えてしまう効果で、
ニュートラルレッド取り入れを抑制する。
ニュートラルレッド測定のひとつの利点は
生細胞のみを発見できることである。同じ培養で
ケンアッシドブルー測定とニュートラルレッド測定
の両方を行うことは可能である。
例えばニュートラルレッド評価値を得れば
細胞はそれまでには ●
法を使用して蛋白質測定ができ $k!#
化学品がリソソームに効果を与えると
疑われる場合、両方の測定をすれば
ニュートラルレッド測定法の
感度チェックの手段が得られる。
試験状況
ニュートラルレッド取り入れ細胞毒性試験システムは
現在いくつかの研究グループにより、違う結果を
比較する共同計画に使用されている。
European Commission と、そしてScandinavian Society of Cell toxicology によって組織されたMulticentre Evaluation of In Vitro Cytotoxicity(MEIC)計画を含む。
試験化学品
１００の純化学品と２０の製剤がこれらの作者による
システムで試験されている。この方法を使用した結果は
幾人かの作者によって公表されている；我々のだした結果はReddell et al., 1986のにある。
二塩化物ジブチル錫
塩化トリブチル錫
塩化ベンザルコニウムクロリド
硝酸銀
塩化水銀
ブリッジ３５
ドデチル硫酸ナトリウム
ｎヘキサン
蛍光色素
トルエン
クロロホルム
アセドアルデヒト
トリエタノールアミン
酢酸トリアセチン
水酸化ナトリウム
ｎブタノール
２メキシ８エタノール
メチルスルホキシド
グリセロール
２ーブトキシエチル アセテート
※
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