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この方法は、リンパ球から周辺の媒体へのＤＮＡと 乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ,EC.1.1.1.27)の漏出量を 測定して細胞毒性の目安とする。 この方法は、細胞活性(ＭＴＴ検定)の測定として、 細胞内（ミトコンドリアの）ジアフォラーゼ検定を 含む。

論理的説明

急性毒性は、HeLaの細胞とその他の細胞株を 使用したMITー24系を含むいくつかの 細胞系で検知できる。ヒトのリンパ球で、特に無傷の 細胞からの脱水素酵素を失うような、より敏感な エンドポイントを伴う細胞毒性をより感度良く判断する。 リンパ球はＢとＴーリンパ球の混合である。 両者とも異種抗原や細胞を成す抗原に反応する。 Ｂ細胞は免疫グロブリンを合成し、Ｔー細胞は （サプレッサ、ヘルパー、キラー細胞）調節をするのともに他の機能がある。リンパ 球インターロイキン ー２受容体はフィトヘモアグルチニンで活性する。 Ｔ−細胞の結果、特に抑制細胞はフェーズＧを離れ 細胞周期のフェーズＳに入り、分裂を始める。 このため数日間の培養後、スプレッサＴ−細胞は 生息している。リンパ球はこれらの条件の下で、 数週間培養できる。リンパ球の増殖は それ程簡単ではないので、蛍光法を使用する。 蛍光法は、光度法を使用するより感度が良く、 必要とする細胞の数を最小限にする。（増殖中、 培養中の困難を考慮すると最重要）

この試験の原理は以下のとおり。毒性化学品は 細胞膜を分裂させ、その結果外部媒体の中に LDHとDNAを増やす。結果として出た毒性は、 損傷細胞から５０％のDNAまたはLDAの漏出を 起こす化学品濃度に換算して表す。

基本手順

リンパ球を抗凝固処理済みのヒトの正常な 血液サンプルから分離する。細胞を5日間成長させ 遠心分離器にかけ、再び完全倍地に浮遊させる。 1mlの細胞検査液のサンプルを２４ウェル皿に 等分し、適切に希釈した試験化学品を加える。 細胞を２４時間培養してから、細胞検査液の アリコートを除く。それから検査液は遠心分離器にかけ、 ＭＴＴ検定と同様にＬＤＨとＤＮＡ漏出の検定を行う。 次にそれぞれの検定にＬＣ５０値を計算する。

重要評価

ＤＮＡ漏出量も乳酸脱水素酵素活性も蛍光で 測定できる。これは従来の光度手順より１０００Ｘ 感度が高い。ＬＤＨ活性は２４時間以上の 細胞数に比例し、検出の低い方の限界は 細胞数約１０００個である。ＤＮＡ漏出の評価 によると、同じような比例であるが、検出の低い方の 限界は、ＬＤＨ検定に必要とされるものより１０倍 高かった。

ＬＤＨ検定使用で得たＬＤ５０値は 普通ＤＮＡ検定で見つかったものより低い。 これは全く驚くことでもない。ＤＮＡ漏出が起る ためには、細胞により広範囲な損傷が必要と なるからである。ＢＣＬ−Ｄ１のような細胞 株から今まで試験された殆どの化学品まで の細胞の培養より、リンパ球培養は 少し感度が高い。しかしＨｅＬa細胞(形態的 エンドポイント)には大きな違いはないようだ。 それはリンパ球の培養において 通常ＬＣ５０値は低いからである。 ウアバインは例外である。

ＭＴＴ値の一番低い対応と共に、ヒトのＬＤ値における生のデータとＭＴＴ，ＬＤ Ｈ，ＤＮＡ検定からのＬＣ５０値の相互間系はかなり良い（相関係数 それぞれｒ＝ 0,68 r=0,67 とr=0,68）。

試験状況 ; 研究室間検証

試験化学品

アミトリプチン、 ベンジルペニシリン、 カフェイン、クロロキン、シクロヘキシミド、 ジニトロフェノール、イミプラミン、リカドイン、リチウム、クロリド、メチルドーパ、 ニコチン、ノスカピニ、ウアバイン、フェノール、フェルブタゾン、プリロカイン、 プロカイン、プロメタジン、キニーネ、フッ素ナトリウム、テオフィリン、ベラパミル

化学品はSigma ChemicalCo.,St.Louis、ＭＯ，USAか Merck Darmstdt、FRGより入手。入手可能な限りで 純度は最高。テオフォリン、ノスカピン、アミトリプチリン、リドカイン、フェニルブタゾン、 プロメタジン、はデンマーク、コペンハーゲンのDAKより贈与。 ベラパミル、プリロカインはそれぞれ コペンハーゲンErchpharmと スエーデンAstraより贈与。

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