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潅流細胞培養の細胞膜浸透性は、［３Ｈ］ー ２ーデオキシーＤーグルコースー６ーりん酸の 流出で判断され、化学薬品の細胞毒性作用の 表示とする。

連絡先；スエーデン（詳細は原文参照）

論理的説明

試験期間中は、従来の培養法より安定した環境の 潅流試験槽の中で、細胞の培養を維持する。 試験化学薬品の細胞毒性は、原形質膜への損傷能力で 評価する。次にこの作用は、その細胞の２ーデオキシーＤ−グルコースー６ーりん酸 の流出の測定で数値化する。

細胞毒性損傷の表示としての、細胞膜透過性の使用； 毒性媒体が細胞に辿り着く際、最初に遭遇する障壁は 原形質膜である。この要因にプラスして、多くの化合物からの攻撃を受けやすい理由 は、原形質膜の、 生命維持を規制する数多くの先天的 メカニズムと、その化学的構成のためである。 つまり細胞膜への損傷は、細胞毒性の優れた表示となる。

細胞膜浸透性の研究において［３Ｈ］ー２ーデオキシーＤーグルコースのプローブと しての使用； このプローブは、単細胞培養で変化する 通常の細胞膜透過性を判定するための、適した 手段であることが証明されている。Ｄーグルコース 類似体としての２ーデオキシーＤーグルコースは、 グルコース輸送システム経由で細胞に敏速に 吸収され、予想どおりその後、ヘキソナーゼを 伴う反応においてりん酸化する。

生成物の２ーデオキシーＤーグルコースー ６ーりん酸が細胞内に蓄積する理由が いくつかある。；ヘキソナーゼは フィードバック阻害ではない。生成物は 代謝的に不活性細胞膜であり、この化合物への 透過性は非常に低い。

よって細胞膜が無傷の時、 ２ーデオキシーＤーグルコースー６ーりん酸の濃度が 細胞内で上がる。代謝体が［３Ｈ］ーグループを 維持する方法で、元の化合物はトリチウム化 が可能。

よってトリチウム化した基質をもつ細胞の培養の 結果は、細胞内でのトリチウム化生成物の蓄積となる。 その後に、外部が汚染しているトリチウムの 除去(そして試験化学薬品への暴露)で、 細胞から拡散した［３Ｈ］ー２ーデオキシーＤーグルコースー６ーりん酸の検知が可 能になる。

何らかの方法で細胞膜が損傷していない限り、 この拡散率は非常に低いと予想される。よって 生成物の漏出は細胞膜損傷の程度を示し、これが 化合物の細胞毒性に関係してくる。

基本手順

試験前に、細胞を細胞組織培養グレード皿で４日間 成長させる。この期間後2時間、グルコースはなしで、 ［３Ｈ］ー２ーデオキシーＤーグルコースと 共に培養する。培養を終了し、非常に冷たい ＰＢＳを追加して[３Ｈ］ー２ーデオキシーＤーグルコースの痕跡全てを除く。

次に培養を潅流試験槽に移し、様々な濃度の 試験化合物で補われたＰＢＳ（Ｄ−グルコースを含む）と 共に３７Ｃで１時間潅流する。 代謝体［３Ｈ］ー２ーデオキシーＤーグルコースー６ーりん酸の流出速度は、シンチ レーション・ガラス瓶で ５分ごとに集めた微量の潅流で測定する。

試験の終わりに、細胞はNaOHに可溶化し、 シンチレーション・ガラス瓶に移され、HCIと中性 する。潅流サンプルとその細胞の放射能は、 液体シンチレーションで測定する。試験の終わりに 細胞に残る放射能は、試験の初めに存在した ものと関係があるので、漏出が 起こったであろうことを示す。

潅流サンプルの放射能分析で得た結果を使用することで、 試験化学薬品の濃度、時間に対して漏出を 企てることが可能。管理状況と比較して、 試験化学薬品に暴露した細胞からの漏出の 増加（例；潅流中の放射能レベルが高い、 または細胞から損失が明らかに多い）は、細胞毒性 作用の表れとみなす。

重要評価

試験化学薬品への細胞の維持と暴露、 その細胞毒性（細胞膜損傷で示される）の評価が 比較的シンプルな方法でできる。この手順は 異なる細胞種類にすぐに適合できる。

この検定法は感度が高く、再現可能である。 不安定な細胞環境をもたらす従来の培養手順より、 潅流試験槽を使用したin vitroでの細胞培養には いくつか利点がある。；栄養素とpHレベルの降下、 濃度内の代謝体の増加継続、酸素供給の 問題の可能性(細胞にゆきわたる酸素が 不十分な結果として呼吸振動の起る可能性)など。

これらの問題の多くのは、潅流技術の使用で ある程度まで解決できるであろう。潅流技術は、 細胞を避け代謝の最終生成物の継続的な 通過を可能にし、より一定のpHレベルと酸素濃度を 生産する。

これらの利点があるので、細胞を化学薬品に 暴露する際と、細胞透過を評価する際(例；［３Ｈ］ ー２ーデオキシーＤーグルコースー６ーりん酸の 流出を測定する間)は、試験期間中、潅流試験槽の 使用を勧める。この手順で述べた潅流器具は、 現在使用されている同じようなシステムに比べると、 多くの点で改良がほどこされ、簡素化されている。

培養皿は潅流試験槽の、総合的な部分である。 試験槽の構成はふたつだけなので、(例； 潅流ブロックと培養皿)取り扱いが簡単。 細胞はノーマルな基層の上に成長する、例； 細胞組織培養グレード・プラスティック皿。

これで潅流と非潅流培養の結果が簡単に 比較できる。培養皿の光学的品質と 潅流ブロックの透明性が高いので、 標準の倒立顕微鏡での観察や検査が容易になる。 潅流試験槽は層流庫内で簡単に組み立てできるので、 微生物汚染が減少する。シンプルなシステム なので使用が簡単で信頼性も増す。 [３Ｈ］ー２ーデオキシーＤーグルコースは 生化学的によく特徴付けられたプローブ であり、りん酸化した代謝的に不活性な 生成物が、簡単に蓄積さる細胞中に、 敏速に吸収される。細胞透過性の測定に 感度が高い方法である（蓄積された細胞内の放射能 レベルが高いのと、化合物のサイズが 比較的小さいため）。

試験状況

社内で開発されたこのシステムを、 充分機能していると作者は考えているが、経済的な 理由でこれ以上の試験の立証継続ができない ため、この分野での研究は現在中断されている。

試験化学薬品

トリトン-X-100 、HgCl2 、CH3HgCl2 、(C2H5)3SnCl K2Cr2O7 、ベンゼン、フェノール、アクリルアミド

このシステムを使用している組織；現在なし

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